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Multiplex Immunohistochemistry · mIHC Panel

多色荧光免疫组化(mIHC)解决方案

多因子 biomarker 研究方案能够从个体差异巨大的患者中找到最终获益的人群。数字化病理图像分析 + 样本送检单,一站式交付实验数据与定量分析结果。

肿瘤新药研发组织病理服务

多重免疫组化实验结果数据交付

Data Delivery & Analysis

1数字化病理图像扫描

物镜 20 倍扫描全图,支持物镜加目镜共 200 倍无极缩放,逐层观察染色细节。

案例:肠癌 5 标 6 色数据 —— panCK、CD4、CD8、PD-1、FoxP3
20 倍物镜全图扫描(左),框选区域 200 倍无极缩放观察细节(右)
20 倍物镜全图扫描(左),框选区域 200 倍无极缩放观察细节(右)
案例:肠癌 5 标 6 色 —— Merge 及 PanCK / CD8 / P
案例:肠癌 5 标 6 色 —— Merge 及 PanCK / CD8 / PD-1 / FoxP3 / CD4 单色拆分

2原位类流式细胞计数

输出组织面积、细胞数、细胞百分比等原位定量结果,结合组织类型分割与细胞分型统计,生成细胞表型原位分布图。

应用举例:肿瘤浸润淋巴细胞分析
4A 20X 原图 | 4B 组织类型分割:肿瘤(红)61%、间质(绿)39%
4A 20X 原图 | 4B 组织类型分割:肿瘤(红)61%、间质(绿)39%
4C / 4D 细胞分型统计与细胞表型原位分布图
4C / 4D 细胞分型统计与细胞表型原位分布图

3细胞荧光强度分析

定量细胞上的荧光强度,比较目标蛋白在不同细胞群上的表达水平差异。

应用举例:PD-1 在 CD4 和 CD8 细胞上表达的强度差
图5 PD-1+ 细胞、CD8+/PD-1+ 细胞、CD4+/PD-1+ 细胞上
图5 PD-1+ 细胞、CD8+/PD-1+ 细胞、CD4+/PD-1+ 细胞上的 PD-1 荧光强度对比

4H-score 表达量分析

组织化学评分(Histochemistry Score)是处理免疫组化结果的一种组织学评分方法,将每张切片内阳性细胞数量及染色强度转化为相应数值,达到对组织染色半定量的目的。

H-score = Σ Pi × i (Pi:阳性细胞百分数;i:着色强度 0 / 1+ / 2+ / 3+)

示例:PD-L1 染色 1+ 占 51%、2+ 占 34%、3+ 占 8%,则 H-score = 51×1 + 34×2 + 8×3 = 143。

5
PD-L1 H-score 分析:panCK / CD47 / PD-L1 /
PD-L1 H-score 分析:panCK / CD47 / PD-L1 / Merge 及逐细胞 H-score 热图
TGFβ1 组织类型分割与 0-3+ 四档评分统计(H-score = 219)
TGFβ1 组织类型分割与 0-3+ 四档评分统计(H-score = 219)
空间分析(1)最近距离

计算一种细胞周围与之最近的另一种细胞的距离,最终算出平均距离。

应用举例:肿瘤细胞附近的 PD-1 细胞平均距离计算
图9 panCK 距离 PD-1 的平均距离 35μm(左)及距离分布直方图(右
图9 panCK 距离 PD-1 的平均距离 35μm(左)及距离分布直方图(右)

6空间分析(2)临近度分析

通过设定一种细胞及其分析半径确认"临近度"标准,计算这种细胞周围是否存在另一种细胞,最终得出符合临近度标准的细胞比例。

示例:42% 的肿瘤细胞周围 30μm 范围之内有 CD8 细胞
图10 临近度示意图(30μm 分析半径)及 PanCK 与 CD8 细胞临近度
图10 临近度示意图(30μm 分析半径)及 PanCK 与 CD8 细胞临近度分析结果

7生存曲线分析

结合空间分析-临近度分析,将肿瘤周围 CD8 浸润较高的患者与较低的患者进行聚类,通过生存曲线分析二者生存差异。

文献:NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms15095
图14 按肿瘤与 CD8 临近程度区分患者(Low / High AUC)
图14 按肿瘤与 CD8 临近程度区分患者(Low / High AUC)
图15 临近程度高的患者有较长的生存时间(P = 0.0383)
图15 临近程度高的患者有较长的生存时间(P = 0.0383)

8典型分组统计

多维度分组统计与聚类分析,如 TGFβ1 信号通路蛋白在肿瘤和间质区域的表达水平统计、按 H-score 分区间聚类等。

应用举例:NSCLC 肿瘤浸润淋巴细胞分析(细胞百分比用细胞总数均一化处理)
图16 NSCLC 多重荧光染色及单色拆分(pan-CK / CD4 / CD8
图16 NSCLC 多重荧光染色及单色拆分(pan-CK / CD4 / CD8A / CD20 / CD45RO / FoxP3)
图17 肿瘤浸润淋巴细胞定量分析(Total area / Stroma are
图17 肿瘤浸润淋巴细胞定量分析(Total area / Stroma area / Tumor area)
图18 各免疫细胞亚群与肿瘤细胞的分布相关性(距离密度与统计)
图18 各免疫细胞亚群与肿瘤细胞的分布相关性(距离密度与统计)
各细胞亚群在总区域 / 间质 / 肿瘤区域中的比例分布
各细胞亚群在总区域 / 间质 / 肿瘤区域中的比例分布
TGFβ1通路蛋白H-score聚类热图
图13 50 位结肠癌患者 TGFβ1 通路相关蛋白 H-score 聚类热图(Cancer / Stroma / Normal)

代表性参考文献

References

优化抗体与 mIHC Panel 指标总表

Optimized Antibody & Panel List
指标分类Human(人源)Mouse(鼠源)
T cellCD45, CD3, CD4, CD8, FoxP3, CD45RO, CD45RACD45, CD3, CD4, CD8, FoxP3
Immune CheckpointPD-1, CD47, TIM-3, Lag3, IDO, TIGIT, PD-L1, Vista, GITR, B7H3PD-1, TIM-3, PD-L1, Vista, IFN γ
Immune activationOX40, CD69, HLA-DR, Granzyme B, 4-1BB, CD86Granzyme B, CD25
Myeloid CellCD11b, CD68, CD163, CD33, arginase-1, C5ARCD11b, F4/80, CD86, Arginase-1, CD206
NK cellCD16, CD56NCR1
B cellCD19, CD20CD19
Other immune cellsCD66b, CD103, CD14, TCF1/TCF7, CD1a, CD11C, CD86Ly6G, MPO, CD11C
Extra cellular matrixα-SMA, E-cadherin, MMP-9, MMP-2, Vimentin, pSMAD2, FAP, FGFR2α, TGFβ1α-SMA, Vimentin, pSMAD2
CytokinesIL6, IL17a, IL10AR, TNF-αIL6, IL17a, IL23a
Hot targetACE2, Ki-67, panCK, β-catenin, CK8, CK20, P53, CD31, Histone H3, Cox-2, HBsAg, HBcAg, BCL-2, EGFR, CD73, CD39, Claudin 18.2, CD24, BCMA, p-STAT3(Tyr705), Galectin-1, Galectin-9, PAX-8, p-ERK, Mesothelin, PDGFR, NY-ESO-1ACE2, Ki-67, CD31, p-STAT3(Tyr705), p-ERK, Cleaved Caspase-3 (Asp175)

肿瘤微环境 Panel 列表(Human)

Tumor Microenvironment Panels · Human

免疫检查点与热门靶标(Immune checkpoints and hot targets)

Panel 1Tim-3, Lag-3, PD-1, CD8, PanCK
Panel 2FGFR2, Claudin18.2, CD3, panCK
Panel 3PD-L1, B7-H3, PanCK
Panel 4PD-L1, CD8, CD68, PD-1
Panel 5CD19, PD-L1, CD226, PVR, CD8, p53
Panel 6panCK, CD8, FoxP3, PD-1, CD4, GITR
Panel 7CD68, PD-1, CD8, PD-L1
Panel 8CD3, CD8, PD-1, TIGIT
Panel 9CD47, PD-L1, panCK
Panel 10CD3, FoxP3, CTLA4, CD20
Panel 11pSMAD2, CD4, CD8, FoxP3
Panel 12CD68, MMP-2, MMP-9, panCK
Panel 13panCK, Galectin-1, Galectin-3, Galectin-9
Panel 14Vista, CD4, CD8, CD68
Panel 15panCK, Galectin-1, CD4, PD-L1
Panel 16Vista, Tim-3, PD-1, PD-L1

淋巴细胞分型(Lymphocyte Phenotyping)

Panel 17CD8, CD4, CD20, PD-L1, CD56
Panel 18FoxP3, HLA-DR, CD4, CD68, CD8, panCK
Panel 19CD45, CD4, CD8, CD68
Panel 20HLA-DR, CD68, CD11c, CD19, PD-L1
Panel 21CD11b, CD33, CD68, C5AR
Panel 22panCK, PD-L1, CD3, CD8
Panel 23CD14, CD45, HLA-DR, PD-L1

免疫激活(Immune activation)

Panel 24CD45, CD3, CD14, CD86, HLA-DR
Panel 25CD4, CD8, CD11c, CD69
Panel 26CD68, CD163, HLA-DR, PD-L1
Panel 27panCK, CD4, CD8, FoxP3
Panel 28CD3, CD8, TCF1/TCF7, Granzyme B
Panel 29Vimentin, SMA
Panel 30panCK, NKG2A, CD8, PD-1
Panel 31CD4, CD8, Granzyme B, panCK

肿瘤微环境 Panel 列表(Mouse)

Tumor Microenvironment Panels · Mouse

小鼠淋巴细胞分型(Mouse Lymphocyte Phenotyping)

Panel 1CD11c, Ly-6G, CD3, CD19, F4/80
Panel 2CD4, CD8, F4/80, CD206
Panel 3CD4, CD8, FoxP3, F4/80

T cells(T 细胞)

Panel 4CD3, CD4, CD8, FoxP3
Panel 5CD4, CD8, CD25, FoxP3
Panel 6CD45, CD8, CD25, FoxP3

T 细胞耗竭、激活与增殖(T cell exhausting, activation and proliferation)

Panel 7CD8, Granzyme B, Tim3, PD-1, Ki-67

髓系与巨噬细胞(Myeloid and macrophage)

Panel 8F4/80, CD206, PD-L1, PD-1, CD4, CD8, Ly-6G
Panel 9CD11c, Ly6G, F4/80, CD206

其他(Others)

Panel 10CD31, CD11c, CD3, CD19